肾移植作为终末期肾脏疾病患者的理想治疗方案之一，已挽救了无数患者的生命，改善了其生活质量，但移植肾缺血-再灌注损伤（ischemic and reper-fusion injury,IRI）造成的肾脏慢性纤维化改变，是影响移植物长期存活的主要因素之一。因此如何减轻移植肾缺血-再灌注损伤后的纤维化过程，成为了国内外众多学者的关心问题。据相关文献报道，臭氧可以减轻肾脏缺血-再灌注损伤后的组织细胞凋亡和炎 症反应[1],其机制可能与低氧诱导 因 子-α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）[2]等 多 种 因素有关，但臭氧对缺血-再灌注后的肾纤维化过程是否具有保护作用，目前少有文献报道，本研究欲探讨臭氧预处理对肾脏缺血-再灌注损伤后的纤维化是否具有保护作用及其相关机制。
1材料与方法
1.1模型的建立与分组 从武汉大学实验动物中心购买Wistar大鼠24只，雄性，8周龄，体重在220-270g之间，随机分为3组，每组8只。假手术组（Sham组）：以45mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉后，取腹部正中切口游离双侧肾脏，切除右肾后缝合腹壁；缺血-再灌注组（IRI组）：麻醉后取腹部正中切口游离双侧肾脏，切除右肾，将左肾动、静脉夹闭45min后开通，再灌注8周；臭氧预处理组（OzoneOP组）：术前15d对该组大鼠经直肠吹入氧气和臭氧的混合气体5.0-5.5ml[臭氧浓度为50mg/L,1.0mg/（kg·d）],其余处理同缺血-再灌注组。
1.2主要试剂及仪器 臭氧发生仪（YKS1000）由珠海依科医疗器械有限公司提供，α-SMA、TGF-β1和Smad7单克隆抗体购自Santa Cruz公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所。
1.3样本采集及处理 模型建立8周后，经大鼠下腔静脉采血测定血肌酐（Cr）及血尿素氮（BUN）水平。再以颈椎脱臼法处死各组大鼠，取出肾脏，一部分肾脏组织保存于液氮中用于后续检测，另一部分以4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，用于制作病理切片。
1.4观察指标
1.4.1肾 功 能 Olympus全 自 动 生 化 分 析 仪（Au2700）测定各组大鼠血Cr及血BUN含量。
1.4.2肾组织病理学检查 取出各组大鼠石蜡包埋肾组织标本，按标准步骤制成组织HE染色切片，将其置于光镜下观察组织病理改变，并拍片。
1.4.3 Realtime-PCR 检测肾组织中α-SMA、TGF-β1和Smad7mRNA的含量取部分液氮中保存的各组大鼠肾组织，常规TRIzol试剂抽提总RNA,DEPC水溶解沉淀，核酸蛋白分析仪测定RNA浓度。取总RNA 1μg,逆转录生成cDNA.TGF-β1上 游 引 物：5′-CTTTAGGAAGGACCTGGGTTG-3′， 下 游 引 物：5′-GGTTGTGTTGGTTG-TAGAGGG-3′，扩增产物为140bp;Smad7上游引物：5′-GGCTTTCAGATTCCCAACTTC-3′，下游引物：5′-CGCCATCCACTTCCCTTGT-3′，扩 增 产 物为255bp;α-SMA上游引物：5′-CAACCCCTATA-CAACCATCACAC-3′，下游引物：5′-CCCAAACT-GCTTGCGTAACC-3′，扩增产物为142bp;内参β-actin上游引物5′-TGCTATGTTGCCCTAGACT-TCG-3′，下游引物5′-GTTGGCATAGAGGTCTT-TACGG-3′，扩增产物为240bp.PCR反应条件均为：94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸1min,共扩增35个循环；最后一次为72℃延伸7min.结果以目的基因与β-actin的比值表示。
1.4.4 Western blot 检测肾组织中α-SMA、TGF-β1和Smad7的含量取液氮中保存的各组大鼠肾组织提取蛋白，按BCA试剂盒说明测定蛋白浓度，40μg蛋白上样，10%聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，分离出待检测蛋白后电转，脱脂牛奶室温下封闭2h,TBST漂洗10min×3次，分别加入α-SMA、TGF-β1和Smad7抗体（1∶1 000），4℃过夜，再次TBST漂洗10min×3次，加入二抗（1∶2 000），室温下孵育1h,TBST漂洗10 min×3次，洗 膜后ECL法显色、照相。
1.5统计学方法 SPSS 17.0软件对实验数据进行统计学分析，实验数据用均数±标准差表示，采用方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠血Cr及血BUN含量各组大鼠的血Cr及血BUN检测结果相比，差异无统计学意义（P>0.05,见表1）。
2.2各组大鼠病理切片镜检结果光镜下，Sham组肾组织结构近似正常，未见明显改变，缺血-再灌注组肾组织结构破坏明显，表现为近曲小管上皮细胞坏死，炎性细胞浸润，可见管型，损伤累及近曲小管三段所有细胞。OzoneOP组肾组织损伤明显轻于IRI组，表现为部分近曲小管细胞轻度水肿，偶见近曲小管近端坏死，偶见管型（见图1）。
2.3 Realtime PCR检测各组大鼠α-SMA、TGF-β1和Smad7的mRNA含量与Sham相比，IRI组及OzoneOP组的α-SMA、TGF-β1的mRNA水平明显增高，而Smad7的mRNA水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。OzoneOP组较IRI组而言，α-SMA、TGF-β1的mRNA水平明显降低，Smad7的mRNA水平 明 显 增 高，差 异 有 统 计 学 意 义 （P<0.05）（见图2）。
2.4 Western blot检测各组大鼠α-SMA、TGF-β1和Smad7的蛋白表达水平与Sham组相比，IRI组及OzoneOP组的α-SMA和TGF-β1的表达水平增高，Smad7的表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。OzoneOP较IRI组而言，α-SMA和TGF-β1的表达明显降低，Smad7的表达明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）（见图3）。
3讨论
肾移植是终末期肾病治疗的理想方案，与透析治疗相比，肾移植具有康复率更高，受者存活时间更长等优点[3].而缺血-再灌注损伤是影响肾移植患者预后的一个重大因素，它可以促进慢性移植肾肾病（chronic allograft nephropathy,CAN）的发展[4],导致移植肾纤维化，最终造成肾移植的失败，而这个过程 与TGF-β1/Smad信 号 通 路 的 激 活 密 切 相关[5,6],现今研究认为，TGF-β1可与靶细胞的TGF-β1受体Ⅱ结合，导致TGF-βⅠ型受体的磷酸化，进而使TGF-β转移至TGF-βⅠ型受体上，形成配体-Ⅱ型受体-Ⅰ型受体复合物，进而磷酸化激活下游受体调节型Smads及通用型Smads,使其联合形成转录复合物，转录复合物进入细胞核内后调控如Pal-1等相关靶基因来影响靶细胞的增殖、分化、黏附、转移和凋亡，引起肾小管上皮细胞间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），导致成肌纤维细胞增多及细胞外基质（extracellular matrix,ECM）沉积，最终导致肾小管间质纤维化[7,8].在这个过程中肌成纤维细胞的特异性标志α-SMA表达明显增多。
Smad7作为该信号通路的抑制因子，能与活化的TGF-βⅠ型受体结合，阻止该通路下游受体调节型Smads等的磷酸化，负反馈调节TGF-β1对靶基因的转录[9,10],从而使EMT和ECM减少，最终减轻肾缺血-再灌注损伤所致的肾纤维化。
医用臭氧在临床上应用已有100多年的历史，如今已在治疗腰椎间盘突出症、下肢缺血性疾病、口腔疾病等方面取得了一定的成效[11],相关实验研究已证实臭氧可以减轻大鼠肾的缺血-再灌注损伤后的炎症反应[1],但对缺血后的肾纤维化改变是否具有保护作用，目前少有报道。本实验建立大鼠肾脏缺血-再灌注损伤后纤维化模型，并予以臭氧预处理，对相关指标进行检测，结果显示各组大鼠肾功能指标未见明显差异。光镜下观察各组肾组织切片发现，较IRI组而言，OzoneOP组肾组织结构破坏程度明显减轻，提示臭氧预处理可以减轻大鼠缺血-再灌注肾脏的损伤，减轻肾纤维化程度。
Realtime PCR及Western blot结果表明，臭氧预处理使缺血-再灌注大鼠肾组织中的a-SMA表达减少，提示肌成纤维细胞形成减少，而TGF-β1的表达明显降低，Smad7的表达明显增高，结合肾组织病理检查结果，考虑臭氧可能通过诱导Smad7的表达，从而抑制TGF-β1/Smad信号通路的传导，EMT和ECM生成减少，最终减轻肾缺血-再灌注后的损伤及纤维化程度，但其中确切机制仍需进一步研究证实。
综上所述，臭氧预处理对大鼠肾脏缺血-再灌注后的纤维化有保护作用，其机制可能与影响肾组织TGF-β1、Smad7等的表达有关，这对研究移植肾缺血-再灌注后纤维化的防治方案具有重要的推动作用。
参考文献
[1]Chen H,Xing B,Liu X,et al.Ozone oxidative pre-conditioning inhibits inflammation and apoptosis in a ratmodel of renal ischemia/reperfusion injury[J].Eur JPharmacol,2008,581（3）：306-314.
[2] 王磊，刘修恒，陈晖，等。臭氧后处理对大鼠肾脏HIF-1α的表达及细胞凋亡的影响[J].武汉大学学报：医学版，2014,35（1）：60-63.
[3] 王祥慧。2013肾脏移植国际前沿热点及新进展---What's Hot?What's New?[J].实用器官移植电子杂志，2013,（4）：202-204.